Sra. Brisby: A personagem principal da história. É uma rata que acabou de ficar viúva. Porém, não tem muito tempo para se lamentar disso, pois seu filho Timmy está com pneumonia e pode morrer se ela não conseguir transferir sua casa para um lugar seguro, terá que se mudar, arriscando Timmy a morrer no frio. Uma das personagens mais humanas da animação (apesar de ser uma rata), demonstra suas emoções com clareza, e é extremamente simpática com todos (ás vezes até demais).Jeremy: Com certeza, a graça do filme! Jeremy é um corvo que está à procura do seu grande amor, porém, é muito atrapalhado para isso e sempre precisa de a ajuda da Sra. Brisby para desenrolá-lo de seus barbantes. Apesar disso tem um bom coração e sempre está disposto a ajudar.
Nicodemus: O líder dos ratos fugitivos do EXAME. É um rato que aparenta ser caduco, mais é muito inteligente e perspicaz, fazendo todos o admirarem muito. Morreu em um cilada preparada por outro rato do exame.
Tia Megera: Administra todos os animais da fazenda. É um pouco zangada mais gosta muito da Sra. Brisby e de seus filhos, apesar de viver brigando com Martin.
Sr. Eingts: Um velho camundongo que também é fugitivo do EXAME. Ele ajuda Nicodemus a comandar os ratos, é um pouco mal humorado, mais sempre acaba ajudando.
Justin: O chefe da guarda dos ratos do EXAME, é um jovem rato que está disposto á arriscar sua vida pelos seus amigos, principalmente por Nicodemus. Tem uma grande simpatia e respeito pela Sra. Brisby principalmente por ser a viúva de Jonathan. No final, foi eleito o novo líder dos ratos do EXAME.
Teresa, Martin, Cyntia e Timothy: São os quatro filhos da Sr. Brisby e de Jonathan. Teresa está sempre disposta ajudar a sua mãe com Timmy. Martin quer se mostrar adulto o suficiente para cuidar de todos os seus irmãos, e vive brigando com Tia Megera. Cyntia é apenas um bebê curioso, que vive se metendo problemas tendo seus irmãos no final para salvá-la e Timothy é o filho que está com pneumonia e por isso fica o tempo todo na cama.
Jonathan: Um camundongo fugido do EXAME. Era o marido da Sra. Brisby, morreu comido pelo gato Dragão em uma missão dos ratos. Aparece só no flashback de Nicodemus.
Dragão: O gato da família Fitzgibbon. Tem um olho diferente do outro, é o terror dos animais da fazenda.
Família Fitzgibbon: Família dona da fazenda. Não é vilã, só age como todos os humanos agem.
